الكروموتوغرافيا الورقية والطبقة الرقيقة

الكروموتوغرافيا الورقية والطبقة
الرقيقة

Paper and thin-layer chromatography :

يمكن أن توصف أنواع هذه الكروموتوغرافيا بأنها أنواع من كروموتوغرافيا
امتزاز سائل على صلب ,
وتستعمل في كشف المكونات الضئيلة وتعيينها في المواد الغذائبة مثل
الملونات .

ولكنها محدودة الاستعمال في القياسات الكمية للمكونات الكبيرة للأغذية .

يسمح استعمال السيللوز في الكروموتوغرافيا الورقية باستعمال الماء كطور
ثابت حيث

يمتز بين ألياف السيللوز .

وتستخدم الطبقة الرقيقة مبدأً مشابهاً لاستعمال الورقة ولكن باستخدام
أنواع مختلفة من المواد ,

تسمح بالفصل بالامتزاز أو التبادل الأيوني أو الارتشاح عبر الهلام .

وتتمبز هذه التقنية بفصلها المتفوق للمكونات وسرعة إجرائها مما هو عليه في

الكروموتوغرافيا الورقية .

وتوصف المكونات الفردية في طريقتي الكروموتوغرافيا الورقية والطبقة
الرقيقة بخاصة

قيمة التأخر R retardation value :

التي تعطى بالعلاقة :

R=المسافة التي يقطعها المكون المسافة
التي يقطعها

المذيب .

تستخدم في عمليات الفصل السريع و في تحليل
الكميات القليلة

من المواد و يعود ذلك للاسباب التالية :

1- بساطة الطريقة و عدم الحاجة الى اجهزة معقدة .

2- إمكانية الوصول الى جودة الفصل نفسها التي تعطيها الطرق الكروماتوغرافية
الاخرى .

3- إمكانية الوصول الى فصل انتقائي باستخدام كواشف خاصة .

و تتم عملية الفصل على طبقة رقيقة من مادة الوسط الثابت المفروشة على الواح
مصنوعة من الزجاج او البلاستيك او الالمنيوم .

و يعتمد الفصل في هذه الطرق اما على ظاهرة الادمصاص او ظاهرة الاستبدال
الايوني .

و هذه الظاهر تعتمد على تركيب كل طبقة من الوسط الثابت و الوسط المتحرك .

الا ان تطبيقاتها المعتمدة على ظاهرة الادمصاص هي الشائعة

حيث ينظر الى كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة على انها كروماتوغرافيا ادمصاص .

خطوات العمل بكروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة :

1- تجهيز الواح الطبقة الرقيقة .

2اختيار الوسط المتحرك المناسب.

3- وضع عينة على لوح الطبقة الرقيقة .

4- تظهير البقع المفصولة و التعرف على مكوناتها.

5- حساب معامل الاعاقة Rf(Refracive index)

(1) تجهيز الواح الطبقة الرقيقة ( الوسط الثابت) :

ان المواد المدمصة في TLC هي نفسها المدمصة في كروماتوغرافيا الاعمدة .

هذه الالواح تكون مصنوعة و مجهزة للاستخدام مباشرة .

(2) اختيار المذيب المناسب (الوسط المتحرك)

يعتمد اختيار المذيب على نوع المادة المراد فصلها و قد يكون ضروريا اختيار
عدد من المذيبات لاجراء عملية الفصل و يكون الاختيار التقريبي سهلا .

فالمذيب الذي له قطبية عالية يؤدي الى تحريك البقع مع جبهة المذيب، في حين
ان المذيب غير القطبي لا يؤدي الى تحريك البقع مع المذيب ، و يعتبر
الكلوروفورم و البنزين من المذيبات المتوسطة القطبية التي تستخدم بصورة
واسعة لفصل العديد من المركبات .

(3) وضع العينة

يتم وضع حجم معين في حدود 5-20 ميكرولتر من العينة التي تركيزها 0.1-5%
بواسطة ماصة دقيقة او محقن دقيق على خط نقطة البداة الذي بيعد 2 سم من احد
اضلاع اللوح .
و ينبغي الا يزيد قطر البقعة عن 1سم . و للمحافظة على بقاء البقعة صغيرة
توضع العينة باحجام صغيرة عدة مرات مع التجفيف بعد كل اضافة.

(4) طرق تظهير البقع المفصولة (Visualization Method)

طرق الفصل سهلة في حالة المواد المفصولة ملونة ،

الا انه في اغلب الحالات تكون المواد المفصولة عديمة اللون

و يجب جعلها في هذه الحالة ملونة باستعمال بعض الكواشف ،

و تسمى هذه بكواشف التظهير .

يعتبر اليود من اكثر كواشف التظهير استخداما حيث يتفاعل مع اغلب المواد
العضوية

معطيا متراكبات لها الوان اما بنية او صفراء .

و هناك طرق اخرى مثل تظهير هاليدات الالكيل برش لوح الطبقة الرقيقة

بمحلول مخفف من نترات الفضة حيث تتكون هاليدات الفضة

التي تتفكك بتأثير الضوء معطية بقع سوداء من رقائق الفضة على الطبقة
الرقيقة .

ايضا هناك استخدام مصباح الاشعة فوق البنفسجية و هي غالبا ما تظهر المركبات
المفصولة

على شكل بقع براقة ساطعة على الطبقة الرقيقة و بعضها يظهر عليه فقط

خاصية التالق(Flourescence) .

و هناك ايضا اضافة مادة متالقة الى الوسط الثابت في الطبقة الرقيقة مثل
خليط من كبريتات الزنك و الكادميوم .

و اذا كانت المركبات المفصولة تسبب اخماد التالق (quenching flourescence)

فانها ستظهر على هيئة بقع سوداء على الصفيحة عند تعرضها للاشعة فوق
البنفسجية .

(5) معامل الاعاقة

عند تثبيت كل الظروف على الطبقة الرقيقة و التي تشمل :

1-المذيب المستخدم.

2- المادة المدمصة المستخدمة كوسط ثابت .

3- سمك الطبقة الرقيقة

4- كمية العينة.

فإن اي مركب سيقطع مسافة ثابتة بالنسبة الى المسافة التي تقطعها جبهة
المذيب .

و تعرف النسبة بين المسافة التي تقطعها المادة المفصولة

و المسافة التي تقطعها الجبهة المذيب بمعامل الاعاقة و يرمز لها بالرمز Rf .

و معامل الاعاقة = المسافة التي تقطعها المادة المسافة التي تقطعها جبهة
المذيب

و يكون معامل الاعاقة ثابتا للمركب المعطى عندما تكون كل ظروف التجربة هي
نفسها و هو يمثل احد الصفات الفيزيائية لهذا المركب .

و يمكن التعرف الى المادة المجهولة عن طريق حساب تلك المسافات من نقطة
البداية الى مركز القطعة .

تقنية الفصل:

تجربة

نستخدم الأدوان الموضحة بالشكل

الكروموتوغرافيا الورقية والطبقة الرقيقة Chroma_materials

الكروموتوغرافيا الورقية والطبقة الرقيقة Chroma_materials

يتم الفصل بهذه الطريقة بوضع قطرة من المحلول الذي يحتوي على الخليط المراد
فصل مكوناته على بعد 2سم من احد اضلاع اللوح .

كما في الشكل التالي

الكروموتوغرافيا الورقية والطبقة الرقيقة Filter_loops

الكروموتوغرافيا الورقية والطبقة الرقيقة Filter_loops

ثم يوضع اللوح في وعاء مغطى يحتوي على كمية من المذيب المستخدم بحيث لا
يزيد ارتفاع المذيب في الوعاء عن 1سم .

كما في الشكل التالي

الكروموتوغرافيا الورقية والطبقة الرقيقة Filter_pencil

الكروموتوغرافيا الورقية والطبقة الرقيقة Filter_pencil

و بعد وقت قصير يبدأ المذيب في التحرك الى اعلى مارا بالبقعة

التي تحتوي على الخليط و يبدا فصل مكوناته حسب قوة ادمصاص

كل منها على سطح الوسط الثابت ،

و ينتج عن ذلك فصل بقعة الخليط الى عدة بقع .

و عندما تقترب جبهة المذيب من نهاية اللوح نخرج اللوح من الوعاء

و نقوم بتحديد المكان الذي وصلت اليه جبهة المذيب لمعرفة المسافة التي
قطعها المذيب .
ثم نحدد مواقع البقع المفصولة .

كما في الشكل التالي:

الكروموتوغرافيا الورقية والطبقة الرقيقة Secret_note

الكروموتوغرافيا الورقية والطبقة الرقيقة Secret_note

ونصل إلى النتيجة النهائية كما في الشكل التالي :

الكروموتوغرافيا الورقية والطبقة الرقيقة More_chroma

و تقاس المسافة التي قطعتها البقع مباشرة

اذا كانت هذه المواد المفصولة ملونة

اما اذا كانت غير ملونة فلابد من اتباع احد الطرق المذكورة سابقا لتظهير
البقع .

مثال لعملية فصل

فصل مكونات نبات السبانخ الاخضر بواسطة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة

تعتمد طريقة فصل مكونات النبات الاخضر على اختلاف ادمصاص المادة الخضراء

على سطح هلام السيليكا الموجودة على شكل طبقة رقيقة .

و تشبه هذه الطريقة الى حد كبير طريقة الفصل الكروماتوغرافي بواسطة العمود
.

المواد المطلوبة و تحضير المحاليل :

1-هلام السيليكا

2-كلوروفورم

3-اسيتون

4-بنزين

5- كحول ايزوبروبيلي

6- ايثر البترول الخفيف الذي درجة غليانه تتراوح بين 30-50م

7- رمل معالج بحمض الهيدروكلوريك

8- حضر 25مل من كل من الكلوروفورم و الكاروتين و الكزاينوفيل في
الكلوروفورم بتركيز 10% وزن لوزن w/w .

خطوات العمل

(1)حضر الواح الطبقة الرقيقة و ذلك بمزج كمية مناسبة من هلام السيليكا

مع 3 مل من مزيج مكون من 1 مل كحول ميثيلي و 2 من الكلوروفورم

ثم افرش العجينة على سطح لوح زجاجي باستخدام قضي زجاجي .

(2)استخلص المادة الخضراء من السبانخ و ذلك بأخ 1 جرام من السبانخ

و طحنها في هاون صغير مستخدما 5 مل من الاسيتون أو الكلوروفورم

مع اضافة كمية مناسبة من الرمل و ذلك لتسهيل عملية الطحن .

و افصل المذيب الذي يحوي المادة الخضراء بعد الطحن الجيد.

(3)ضع على لوح الطبقة الرقيقة و على مسافة 2 سم من حافتها

مستخلص السبانخ على شكل قطرات متتالية.

(4)ضع على لوح الطبقة الرقيقة نفس وعلى بعد 2 سم من حافة محاليل

كل من الكلوروفيل و الكاروتين و الكازاينوفيل على شكل قطرات متتالية

بحيث تكون المسافة ما بين البقع الناتجة عن المكونات بحدود 2 سم .

(5) ضع لوح الطبقة الرقيقة في الخزان الكروماتوجرافي الذي يحوي المذيب

المكون من البنزين و إيثرر الرول و الكحول الأيزوبروبيلي

بنسب حجمية 5 : 5 : 1 على التوالي .

وينبغي ألا يصل مستوى سطح المذيب في الخزان

الى بقعة العينة المراد فصل مكوناتها .

(6)اترك لوح الطبقة الرقيقة في الخزان حتى تصل جبهة المذيب

الى ما قبل نهاية الطرف العلوي .

(7)أخرج لوح الطبقة الرقيقة ولاحظ انفصال مكونات العينة

إالى عدة بقع ملونة ،

رتب هذه البقع حسب قوة ادمصاصها و احسب معامل الاعاقة لكل منها .

وتعرف على مل مكون تم فصله من السبانخ بمقارنة لونه

و معامل إعاقتع بلون و معامل الاعاقة لكل من الكلورفيل و الكاروتين و
الكزاينوفيل

ملاحظة

يمكن أن يحمل على خط التحميل أكثر من بقعة حسب عرض الورقة,

بعد جفاف الورقة توضع ضمن المقياس المدرج بحيث لا تمس جدرانه

و بحيث يكون خط التحميل فوق سطح المحل الحامل بحوالي 1cm يغلق الوعاء

و تترك الورقة فترة من الزمن حتى يصل المحل الحامل

الى ما قبل نهاية الورقة بحوالي 2cm .......)

» الكروموتغرافيا الورقية والطبقة الرقيقة