تلوين" صبغ" الخلايا الجرثومية

أولاً : تلوين الخلايا الجرثومية:
الجراثيم الحية عديمة اللون تقريباً , و تباينها مع الوسط المائي المعلقة به لا يكفي لرؤيتها بوضوح، لذلك فإن صبغ أو تلوين الخلايا الجرثومية يجعلها تتباين في اللون عن الوسط الموجود به فتصبح مرئية و مميزة مما يمكننا من دراستها و التعرف عليها بشكل أفضل . تختلف الجراثيم عن الوسط المحيط بها من الناحية الكيميائية مما يمكننا من عملية صبغها أو تلوينها.

ثانياً: تعريف الملونات ( الأصباغ , Dyes )
تسمى المركبات الكيميائية المستخدمة في تلوين الجراثيم بـ الأصباغ Dyes و هي عبارة عن أملاح كيميائية تتكون من شاردة موجبة و شاردة سالبة أحدهما يقوم بعملية التلوين بعد أن يتشرد.
تقسم الملونات إلى:
أ‌- ملونات طبيعية : مثل الهيماتوكسلين , الحبر الصيني .
ب‌- ملونات اصطناعية: و التي تقسم بدورها إلى:
1. ملونات قاعدية.
2. ملونات حامضية .
3. ملونات معتدلة.

1- ملونات قاعدية ( أساسية ): و فيها يعود اللون إلى الشاردة الموجبة مثل الفوكسين و السفرانين و أزرق المتيلين و البنفسجية المبلورة . تمتلك هذه الأصباغ ألفة شديدة للأجزاء الحامضية من الخلية الجرثومية . يمتلك سطح الخلية الجرثومية صفات حامضية بشكل إجمالي بسبب العدد الكبير من الزمر الكربوكسيلية المتوضعة على سطح الخلية .
إن الزمر الكربوكسيلية ( -COOH ) هي الجذور الحامضية للحموض الأمينية , و آلاف الحموض الأمينية متحدة في الجدار الخلوي . لذلك عندما يحدث تأين للزمر الكربوكسيلية فإن سطح الخلية يملك شحنات سلبية :
- COOH - COO - + H+
و لكن بشكل طبيعي تستبدل شاردة الهيدروجين ( H+ ) بشاردة إيجابية أخرى مثل: Na+ أو K+ و تتحد مع الأوكسجين لتشكلا الماء.
تحضر الأصباغ الأساسية ( القلوية ) تجارياً على شكل أملاح
كمثال : عند شراء أزرق المتيلين , فإنه في الواقع كلوريد أزرق المتيلين الذي عندما يتشرد فإنه يتشرد كالآتي :
MB Cl MB++ Cl –

و اللون هنا يعود إلى شاردة المتيلين الأزرق ذات الشحنة الموجبة ( MB+) التي ترتبط بالشحنات السلبية على سطح الجرثوم و هذا تابع لتجاذب الشحنات المختلفة مع بعضها البعض، و عند حدوث هذا تتلون الخلية .

يمكن أن تكتب عبارة موازنة تدل على عملية التلوين كالتالي:
MB+Cl - + Na+ السطح الخلوي الجرثومي
Na Cl + MB السطح الخلوي الجرثومي
و على ذلك فإن تلوين الجراثيم بالتلوين البسيط هو عبارة عن استبدال الشحنات الموجبة و السالبة بين الجزيئات لتشكيل رابط أيوني بين أنواع الملونات و الخلايا البكترية . و ندعو هذه العملية بالتلوين البسيط .

2- ملونات حامضية : و فيها يعود اللون إلى الشاردة السالبة .
تمتلك هذه الأصباغ مثل حمض المر و الإيوزين ألفة شديدة للأجزاء الأساسية من الخلية و التي هي لمكونات سيتوبلاسما الخلية و بالتالي فإنها لن تستطيع الاتحاد مع الشحنة السالبة على سطح الجراثيم بل تكون راسباً حول الخلية , و عندها يظهر الميكروب شفافاً و تظهر الشريحة الزجاجية ملونة و هذا ما يدعى بالصبغ السالب أو غير المباشر .

3- ملونات معتدلة : أيوزينات زرقة المتيلين , أيوزينات الآزوت .

ثالثاً: تحضير و تثبت الغشاء الجرثومي :
قبل إجراء عملية التلوين يجب علينا تثبيت الجراثيم على الشريحة الزجاجية بمعنى أن تلتصق الجراثيم بسطح الشريحة و إلا سوف تزول الجراثيم مع الملونات أثناء عملية التلوين.


التثبيت:
عملية قتل الجراثيم و تجميع بروتوبلازم الخلية و لصقها بسطح الشريحة , ويتم ذلك بالتسخين البسيط , كما يتم باستخدام الكحول 95 % أو مزيج الكحول و الإيتر أو الكحول المتيلي أو محلول حمض الأوسمي 1% و ذلك بغمس اللطاخة لمدة تختلف حسب المادة المستخدمة .

رابعاً : أنواع التلوين :
التلوين البسيط

و فيه يتم استخدام ملون واحد فقط و يقسم إلى:
أ‌- تلوين بسيط مباشر ( ملونات أساسية ) .
ب‌- تلوين بسيط غير مباشر (التلوين السلبي) و يتم باستخدام ملونات حامضية .
و يتم بوضع الملون بتماس المحضر المثبت مدة تتراوح بين دقيقة و ثلاث دقائق حسب كثافة المحلول فيبدو الجرثوم ملوناً بلون ذلك الملون , و يستفاد من هذه العملية لمعرفة وجود أو عدم وجود الجراثيم وتعيين شكلها والتعرف على هويتها إن وجدت على سبيل المثال : طريقة التلوين بأزرق الميتيلين أي معرفة فيما إذا كانت الجراثيم عصيات أو مكورات.

التلوين المركب

و سميت الطريقة بذلك لاستعمال أكثر من ملون واحد فيها , ويعتمد على حقيقة أن الأنواع الجرثومية تختلف فيما بينها فيزيائياً و كيميائياً و بالتالي فإنها تتفاعل بدرجات مختلفة بالنسبة لطريقة صبغ معينة , و بالتالي يمكننا استخدام هذه الطريقة كأساس للتمييز بين أنواع البكتريا , و تتم بثلاث عمليات :
التلوين – الترسيخ – و التمييز.
• التلوين: هو وضع الملون المراد استعماله لمدة معينة.
• الترسيخ: و هو تقوية فعل الملون باستعمال محلول لوغول , أو حمض الفيني 2% أو حمض الخل 1% .
• التمييز: و هو توضيح المحضر و إعطائه دقة أكبر و ذلك بطرح الزائد من الملون باستعمال الغول المطلق , أو مزيج الغول و الخلون , أو حمض كلور الماء , أو حمض الكبريت الربعي .

خامسا: طرائق التلوين :
هنالك طرق عديدة للتلوين و سنستعرض أهم هذه الطرق و هي :
1. طريقة أزرق الميتيلين .
2. طريقة غرام .
3. طريقة غيمزا .
4. ملون رايت .
5. طريقة فونتانا – تريبوندو .
6. طريقة تسيل – نلسون .
7. طريقة ليفون .
8. طريقة الحبر الصيني .


منهج كلية الصيدلة بحلب
د . روعة كيالي
د . ميساء محفوض